中東呼吸綜合征冠狀病毒感染的常規檢測方法是通過實時反轉錄PCR 反應和測序鑒定。有適當經驗和生物安全條件的實驗室可以嘗試用細胞分離病毒檢測，但不屬于常規檢測，本指南中未包含病毒分離的步驟。此外，鑒于我國尚無中東呼吸綜合征冠狀病毒標準毒株和血清學檢測試劑，此版技術指南暫不包括血清學檢測內容。

    任何中東呼吸綜合征冠狀病毒的檢測都必須在適當條件的實驗室由經過相關技術安全培訓的人員進行操作。

目前病毒核酸的檢測方法主要有檢測E 蛋白上游基因（upE）、ORF1b 基因和ORF1a 基因三種。這些方法均高度敏感，檢測ORF1b 基因的方法不如針對ORF1a 的方法敏感，但比其更加特異。另外，已確定了中東呼吸綜合征冠狀病毒基因組中位于RNA 依賴的RNA 聚合酶（RdRp）和衣殼蛋白（N）基因的幾個適合測序驗證的靶序列。

     在實驗室要確認一個樣本為陽性，需要滿足以下兩個條件的其中

一個：

（一）至少兩種中東呼吸綜合征冠狀病毒特異性PCR 結果陽性；

（二）一種PCR 結果為陽性，另外一種PCR 產物序列測序，與已知序列相符。

     當針對中東呼吸綜合征冠狀病毒的兩種不同的檢測方法結果不一致的時候，應當采用反轉錄PCR 擴增，對擴增產物進行測序以確認檢測結果。

     陰性結果也不能排除臨床病人的感染，一些因素可能產生假陰性，包括：樣本質量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本；樣本收集的過早或過晚；沒有正確的保存、運輸和處理樣本；技術本身存在的原因，如；病毒變異，PCR 抑制等。

     當PCR 檢測結果為陰性，但臨床表現和流行病學特點提示是中東

呼吸綜合征冠狀病毒感染時，可采用血清學方法進行檢測。雙份血清

標本能夠滿足血清學檢測的要求。

熒光定量PCR 方法檢測中東呼吸綜合征冠狀病毒核酸標準操作程序

1、目的

  規范熒光定量PCR 方法檢測中東呼吸綜合征冠狀病毒核酸的工

作程序，保證實驗結果的正確可靠。

2、范圍

  適用于熒光定量PCR 方法檢測中東呼吸綜合征冠狀病毒核酸。

3、職責

檢測人員：負責按照本檢測細則對被檢樣本進行檢測。

復核人員：負責對檢測操作是否規范以及檢測結果是否準確進行

復核。

部門負責人：負責對科室綜合管理和檢測報告的審核。

4、樣本接收和準備

4.1 核對被檢樣本姓名、性別、年齡、編號及檢測項目等。

4.2 待檢樣本的狀態如有異常，需注明。

4.3 待檢樣本應存放于-70℃。

5、本方法檢測項目為中東呼吸綜合征冠狀病毒核酸測定（熒光

定量PCR 方法）

6、檢測儀器設備和材料

6.1 熒光PCR 檢測儀（ABI7000 或相似性能產品）

6.2 計時器

6.3 德國VITLAB移液器（10μl，100μl，1000μl），準確度±2%

6.4 微型振蕩器

6.5 一次性手套

6.6 含氯消毒劑

7、檢測環境條件

實驗應在20℃-25℃室溫中進行。

8、診斷試劑和材料

8.1 引物和探針：

upE：

upE-Fwd 5’-GCAACGCGCGATTCAGTT-3’

upE-Rev 5’-GCCTCTACACGGGACCCATA-3’

upE-Prb 5’FAM-CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG-TAMRA 3’

ORF1b：

ORF1b-Fwd 5’-TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT-3’

ORF1b-Rev 5’-TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG-3’

ORF1b-Prb 5’FAM-CCCGTAATGCATGTGGCACCAATGT-TAMRA 3’

8.2 QIAamp Viral RNA mini kit

8.3 PCR 反應管：96 孔PCR 反應板和透明封膜或PCR 反應管和透

明蓋。

8.4 DEPC 水

8.5 AgPath one-step RT-PCR kit

9、檢測原理

Taqman 熒光探針為一段特異性寡核苷酸，兩端分別標記一個熒

光基團和一個淬滅基團。探針完整時，熒光基團發射的熒光被淬滅基

團吸收；而PCR 擴增時，聚合酶的5’-3’外切酶活性將探針切斷，

使熒光基團和淬滅基團分離，發射熒光。每一分子的產物生成都伴隨

著一分子的熒光信號產生，通過對熒光信號累積的監測實現對整個

PCR 過程的實時監測。該方法由于靶序列由引物和探針雙重控制，特

異性好，假陽性低。

10、檢測步驟

10.1 病毒核酸（RNA）的制備：

10.1.1 樣本要求：咽拭子（或其他呼吸道樣本）；全血或血清。

10.2 準備提取試劑（在使用前進行）：

10.2.1 Buffer AVL 工作液的制備

將試劑盒提供的Buffer AVL 液1ml 加入到1 管凍干的Carrier

RNA 中, 混合均勻, 徹底溶解Carrier RNA。在第1 次使用前將溶解

的Carrier RNA 加入到1 瓶Buffer AVL 中, 制成Buffer AVL 工作液，

保存于2-8℃（穩定性為48 個小時）。在2-8℃條件下, Buffer AVL/

Carrier RNA 混合物可能會析出沉淀, 可在使用前80℃溫育使之融

解。

10.2.2 Buffer AW1 工作液的制備

試劑盒中Buffer AW1 以濃縮液的狀態提供。第1 次使用前, 按

照試劑瓶上的說明向其中加入規定量的無水乙醇制備成工作液。

Buffer AW1 工作液在室溫條件下可穩定保存1 年。

10.2.3 Buffer AW2 工作液的準備

試劑盒中Buffer AW2 以濃縮液的狀態提供。第1 次使用前, 按

照試劑瓶上的說明向其中加入規定量的無水乙醇制備成工作液。

Buffer AW2 工作液在室溫條件下可穩定保存1 年。

10.3 病毒核酸（RNA）提取步驟：

所有試劑在使用前應平衡至室溫；所有離心步驟應在室溫下進

行。

10.3.1 取n＋1 個1.5ml 滅菌塑料離心管, 作好標記。n=樣本數

10.3.2 每個塑料離心管加560ul Buffer AVL 工作液。

10.3.3 將140ul 待測樣本及對照樣本加到上述離心管中,振蕩

混勻15 秒, 室溫孵育10 分鐘。

10.3.4 短暫離心后加入560μl 無水乙醇, 振蕩混勻15 秒, 再

短暫離心。

10.3.5 取步驟10.3.4 得到的混合物630μl，加入到QIAamp RNA

提取柱中（帶有2ml 的集液管）, 蓋上管蓋，6000×g 離心1 分鐘。

10.3.6 更換新的集液管, 將10.3.4 剩余的樣本加入到QIAamp

RNA 提取柱中，蓋上管蓋，6000×g 離心1 分鐘。

10.3.7 更換新的集液管, 打開管蓋, 加入500ul Buffer AW1 工

作液，6000×g 離心1 分鐘。

10.3.8 更換新的集液管, 打開管蓋, 加入500ul Buffer AW2 工

作液，20000×g 離心3 分鐘。

10.3.9 更換新的集液管, 20000×g 離心1 分鐘。

10.3.10 將QIAamp RNA 提取柱置于新的1.5ml 離心管上, 小心

的打開管蓋, 加入60μ1 洗脫液Buffer AVE, 蓋上管蓋, 室溫條件

下孵育1 分鐘, 6000×g 離心1 分鐘, 收集濾出液, 做好標記, 4℃

保存備用。

10.4 熒光定量PCR 檢測：

10.4.1 熒光定量RT-PCR 反應液的準備：

每個待檢樣本反應液的組成為：

2×RT-PCR buffer：12.5μl

25×RT-PCR enzyme mix：1μl

引物（5mM）：各1μl

探針（5mM）：0.5μl

Detection enchancer：1.67μl

加水至20μl

10.4.2 每反應管中加入待檢核酸5μl，蓋緊管蓋或封好透明膜,

置于PCR 檢測儀上。

10.4.3 擴增條件設定：

45℃,10min；95℃,10min；95℃,15s,60℃,1min,共40 循環。

10.4.4 儀器檢測通道選擇：

使用ABI7000 熒光PCR 檢測儀時選擇Fam 熒光信號,收集設在

60℃。具體設置方法請參照各儀器使用說明書。

10.4.5 結果分析閾值設定：

使用ABI7000 熒光PCR 檢測儀進行結果分析時,基線（baseline）

取3-10 或6-15 個循環的熒光信號,闕值設定原則以闕值線剛好超過

正常陰性對照品擴增曲線的高點,也可根據儀器噪音情況調整。

11、熒光定量RT-PCR 反應系統的質量控制：

反應結果應同時符合以下3 個條件，否則試驗結果無效。

11.1 陰性對照：無擴增, 為陰性。

11.2 強陽性對照：Ct 值<25。

11.3 臨界陽性對照：Ct 值<35。

12、結果判斷：

12.1 陰性: 無Ct 值或Ct 為40。

12.2 陽性：Ct 值<37, 可報告為陽性。

12.3 Ct 值在37-40 之間的樣本建議重做, 若重做結果Ct 值< 37，

該樣本判斷為陽性, 否則為陰性。